故障排除技巧

不使用带正电的载玻片会导致组织损伤。

需要使用带正电荷的载玻片或附着力载玻片。带正电的玻片有助于带负电的组织附着。
或者，一些用户将载玻片加热到~50°C 30秒到1分钟，然而加热载玻片可能会产生其他后果，如细胞形态的变化。

不正确的固定词。

参考IFU确定合适的固定剂;乙醇常用于组织学，但通常是一种不理想的抗体测定固定物。

组织在定。

固定是免疫测定组织准备的重要组成部分。

载玻片含有过多的固定剂。

固定后，让载玻片风干大约。1分钟，用1X洗涤缓冲液冲洗。

脂肪和/或其他非标准组织会导致组织损失。

脂肪组织可能不能可靠地粘附在显微镜载玻片上。在某些情况下，通过加热固定组织切片可能有助于防止组织损失。在切割脂肪、软骨、骨或其他非标准组织时，用户还可以应用不同的切割技术和低温恒温器温度，以帮助它们更好地附着在载玻片上。每组组织可能需要独特的固定方案。

用实验室清洗瓶冲洗的压力太大。

剪断实验室洗漱瓶的尖端，从幻灯片的顶部开始向下冲洗。
另一种选择是通过载玻片架将载玻片浸入水槽或染色桶中。在洗涤液中摇载玻片30-45秒。

染色桶/洗涤槽/科普林瓶组织丢失。

清洗滑片时要小心/放慢速度，以免在清洗浸泡过程中丢失组织。带电载玻片有助于防止组织流失。

幻灯片的选择。

选择带正电的载玻片以帮助组织附着在载玻片上。
一些使用者也可能尝试使用不带电的滑片，但使用热量来粘附组织。虽然对无电荷载玻片加热可以帮助组织粘附，但我们建议谨慎使用，因为加热过程也可能导致组织形态发生不良变化。

组织切片切得太厚。

厚切组织可能意味着重要的和潜在的诊断区域的组织可能被低估或遗漏。ihcDirect IHC检测的最佳组织厚度被认为是~4-6µm。用户应优化和验证厚度的程序。

当组织从体内取出，保存不当或保存不够快时，会发生细胞自溶或自我消化的欠固定组织。

欠固定的组织可能导致一抗和发色原以非特异性的方式与坏死细胞或细胞成分结合。用户可能希望将固定时间延长到2-3分钟来补偿。

孵育时间过短，未应用或冲洗掉-未阻塞的内源性组织元件与一抗和/或显色剂无特异性相互作用。

确保在建议的时间内完成阻塞;在抗体应用和孵育之前，不应冲洗掉阻滞剂。一旦使用和培养，用户应拍掉多余的阻断剂，并清除多余的阻断剂从周围的组织与金擦拭或毛巾。

不正确的ihc洗涤缓冲稀释。

用刻度缸将10X ihc洗涤缓冲液稀释至1X = 1份10X缓冲液+ 9份去离子水或蒸馏水。
在室温下储存ihc洗涤缓冲液。如果缓冲液变得混浊或有颗粒，让试剂平衡到室温。在将洗涤缓冲液稀释至1倍浓度之前充分混合。

抗体孵育时间过长——溶液中未结合的抗体可以非特异性地结合到组织标本中的坏死细胞或细胞成分上。

将抗体培养时间调整到指定的或通过高质量的实验室程序验证的时间;增加冲洗时间(DAB=使用洗涤瓶，每张幻灯片10-15秒，所有幻灯片都要清洗)(洋红色=使用带架子的染色盘，积极摇动幻灯片30-45秒)。

不正确的DAB工作溶液浓度(在稀释微管内)-发色剂与稀释剂的比例不正确，试剂过期，和/或蒸发的发色剂或混合工作溶液因过度暴露于空气而变得过于浓缩。

制作新一批DAB。
使用DAB Kit，每1ml稀释剂混合1滴(30 μ l)显色剂。用ihc DAB 1:1制备等体积的显色剂稀释。在任何一种情况下，将混合物在微管中翻转几次，以确保混合成功。

显色剂孵育时间过长-显色剂会非特异性结合。

使用经过验证的培养时间;在某些实验室环境中，缩短孵育时间可能是必要的;使孵育时间减少1分钟;增加冲洗时间(DAB=使用洗涤瓶，每张幻灯片10-15秒，所有幻灯片都要清洗)(洋红色=使用带架子的染色盘，积极摇动幻灯片30-45秒)。

培养温度过暖或过冷。

在21-30°C之间运行IHC;使用校准的温度计来测量房间和/或滑动温度。使用ihc滑片管理器时，测量设备表面的温度，而不是滑片加热器表面的温度。一般情况下，ihc Slide Warmer上的温度设置为34.5°C-35°C，以实现ihc Slide Manager表面的30°C。

人工制品/折叠-显色原被困在折叠/人工制品在冷冻过程中创建。

确保刀片锋利，干净，角度合适(~5°)。然后是切除块。
用带喷嘴的喷雾瓶在载玻片上清洗纸巾时要小心。用1X冲洗缓冲液轻轻冲洗载玻片上的组织，这样喷射的力不会使组织边缘翻转到邻近组织区域的顶部。

组织切片太薄。

IHC的理想组织厚度为4-6µm;薄组织切片有破裂或产生较弱信号的风险。用户应优化和验证厚度的程序。

脂肪和/或其他非标准组织会导致组织损失。

脂肪组织不像其他组织那样粘附在显微镜载玻片上;建议加热组织切片以防止组织丢失;在切割脂肪、软骨、骨或其他非标准组织时，用户可能需要使用不同的切割技术和低温恒温器温度。每种组织可能需要独特的固定方案。

组织在室温下冷冻时间过长-将新鲜组织不固定或冷冻会导致抗体结合位点(表位)的丢失。

一旦组织被切除，尽快将组织嵌入OCT中，然后将卡盘留在低温恒温器中，直到准备切割载玻片;如果组织块不能立即处理，建议用OCT覆盖。

切片组织在室温下放置时间过长-表位和/或细胞形态丢失。

在低温恒温器附近放置固定剂，切割后立即或短时间内固定组织。

不使用带正电的载玻片会导致组织损伤。

带正电的载玻片可以帮助带负电的组织附着。

固定不足导致蛋白质变性/降解-固定后，切片组织在室温下放置时间过长可能会干燥导致表位和/或细胞形态的丧失。

固定是免疫测定前组织准备的重要组成部分。
根据数百名用户的经验，固定组织1-2分钟似乎是所需的最小固定量。有些人固定组织的时间更长，这取决于他们处理的是哪种组织。
固定后，将载玻片放入装满1X洗缓冲液(PBS- t)或PBS溶液的染色皿或科普林瓶中，直到准备好开始IHC方案。这样可以保持组织湿润。

不正确的固定剂。

参考IFU确定合适的固定剂;乙醇常用于组织学，但通常是一种不理想的抗体测定固定物。

用洗涤缓冲液漂洗后，多余的OCT残留在载玻片上-防止抗体与抗原结合。

在温PBS- t中清洗两次，在微波炉中加热两个塑料铜管罐，将50mL PBS/Triton加热到45°C，并在每个罐中冲洗5-10秒。

用实验室清洗瓶冲洗组织时产生的洗涤缓冲流压力过大。未切割的实验室洗漱瓶喷嘴尖端可以划破组织时，直接适用于组织。

切断清洗瓶的喷嘴尖端，从滑片顶部向下轻轻冲洗组织，这样清洗缓冲液就会流过组织，而不是直接流到组织上，这样可以防止组织流失。另一种选择是使用带架子的染色盘，在洗涤缓冲液中上下摇动幻灯片。

不平整的表面或整个组织未覆盖-试剂可能会流到载玻片背面或不均匀地染色组织。

在清洗或阻塞步骤之后清除多余的液体，以保持载玻片背面干燥。将抗体直接涂在组织上，用抗体、阻滞剂或发色剂完全覆盖组织。保持载玻片表面平整，防止染色不均匀。一个坚实的实验室工作台或水平工具，如靶心水平仪可以帮助确保有一个水平的表面。

试剂储存和处理不当。检测元件的污染和降解。如果检测组件的完整性受到损害，正确的绑定可能会受到负面影响
染色减弱。

确保所有试剂根据各自的试剂包装标签正确存储:A)在室温15-30°C下存储10X洗缓冲液，即使在单个瓶已打开后。制备后仅存储1X洗涤缓冲液。如果洗涤缓冲瓶已存放在冰箱中，出现颗粒，请等待瓶子恢复室温后再混合。一旦10X瓶达到平衡，颗粒一般就会消失。有关进一步说明，请参阅ihc清洗缓冲区IFU。B)使用前约15分钟将ihcDirect试剂从冰箱中取出，使试剂平衡。C)抗体到达时已被稀释，并可在长时间储存后沉淀。在将抗体应用于组织之前，翻转或轻轻旋转或摇动瓶子10-20次。

孵化温度过低。较低的实验室温度会减缓抗体-抗原反应，导致染色较轻或没有染色。

在21-30°C之间进行免疫组化试验。为了适应较低的温度，用户可以购买免疫组化切片加热器或延长培养时间以适应实验室环境;
使用校准的温度计来帮助验证室温和/或玻片温度是否满足孵育期间的最低要求。

在载玻片上留下过多的1X洗涤缓冲液会导致显色剂稀释。

确保将多余的1X清洗缓冲液从载玻片上擦除，并使用Kim Wipe或吸水毛巾清除组织周围和载玻片背面的多余液体。

不相容的酶-显色素相互作用。

只使用hrp兼容的显色剂。

固定不足导致蛋白质变性/降解-固定后，切片组织在室温下放置时间过长可能会干燥导致表位和/或细胞形态的丧失。

固定是免疫测定前组织准备的重要组成部分。
根据数百名用户的经验，固定组织1-2分钟似乎是所需的最小固定量。有些用户固定组织的时间较长，例如3分钟或更长时间，这取决于他们处理的组织。
固定后，将载玻片放入装满1X洗缓冲液(PBS- t)或PBS溶液的染色皿或科普林瓶中，直到准备好开始IHC方案。这样可以保持组织湿润。

不正确的固定剂-使用其他固定剂，如酒精，可能导致缺乏足够的蛋白质保存。这些固定物也可能破坏或改变靶标表位。如果靶抗原/表位受损或变性，抗体就不能成功地与抗原结合。

确定组织的最佳固定剂，一般为丙酮或10%中性缓冲福尔马林。如果信号太弱，使用者可能会尝试长时间固定纸巾(例如2-3分钟)。

固定剂浓度不足——因为固定剂会因重复使用而稀释或长时间不有效。

确保定期刷新用于固定幻灯片的固定容器。建议至少每隔一周更换一次。用户想要最大限度地使用他们的固定剂可能不得不延长固定时间，以弥补稀释或不有效的试剂。

阻滞剂潜伏期过短(或完全没有)——未被阻断的内源性组织元件与一抗和/或显色原无特异性相互作用。

确保阻塞试剂是新鲜的，并将试剂添加到组织中以推荐的时间。

在载玻片上残留过多的阻滞剂可导致偶联抗体稀释。

一旦使用并孵育阻断剂，使用者应使用Kim Wipe或吸收擦拭从组织周围去除多余的阻断剂，以优化抗体-表位结合。

抗体孵育时间过短，表位-抗体结合极少;抗体没有足够的时间定位并与目标结合。

使用经过验证的培养时间;有些医生喜欢看到更暗的信号。为了获得较暗的信号，用户可以试验较长的孵育时间(例如从3分钟增加到4-5分钟)。用户应验证任何增加的培养时间是否达到规定的水平，或通过高质量的实验室程序进行验证。

不平整的表面或整个组织未覆盖-试剂可能会流到载玻片背面或不均匀地染色组织。

在清洗或阻塞步骤之后清除多余的液体，以保持载玻片背面干燥。将抗体直接涂在组织上，用抗体、阻滞剂或发色剂完全覆盖组织。保持载玻片表面平整，防止染色不均匀。一个坚实的实验室工作台或水平工具，如靶心水平仪可以帮助确保有一个水平的表面。

试剂储存和处理不当。检测元件的污染和降解。如果检测组件的完整性受到损害，正确的绑定可能会受到负面影响
染色减弱。

确保所有试剂根据各自的试剂包装标签正确存储:A)在室温15-30°C下存储10X洗缓冲液，即使在单个瓶已打开后。制备后仅存储1X洗涤缓冲液。如果洗涤缓冲瓶已存放在冰箱中，出现颗粒，请等待瓶子恢复室温后再混合。一旦10X瓶达到平衡，颗粒一般就会消失。有关进一步说明，请参阅ihc清洗缓冲区IFU。B)使用前约15分钟将ihcDirect试剂从冰箱中取出，使试剂平衡。C)抗体到达时已被稀释，并可在长时间储存后沉淀。在将抗体应用于组织之前，翻转或轻轻旋转或摇动瓶子10-20次。

孵化温度过低。较低的实验室温度会减缓抗体-抗原反应，导致染色较轻或没有染色。

在21-30°C之间进行免疫组化试验。为了适应较低的温度，用户可以购买免疫组化切片加热器或延长培养时间以适应实验室环境;
使用校准的温度计来帮助验证室温和/或玻片温度是否满足孵育期间的最低要求。

在载玻片上留下过多的1X洗涤缓冲液会导致显色剂稀释。

确保将多余的1X清洗缓冲液从载玻片上擦除，并使用Kim Wipe或吸水毛巾清除组织周围和载玻片背面的多余液体。

显色原孵育时间过短。

使用经过验证的培养时间;增加培养时间可能是必要的，以规定或通过高质量的实验室程序验证。

使用错误的脱水方法或不适当的安装介质-如果与酒精或非水性安装介质一起使用，非永久性显色剂会褪色。

确保您的脱水/清除试剂，显色剂和安装介质都是兼容的。这应该针对每种组织类型、固定方案和所需的免疫染色强度进行优化。

冷冻文物-冷冻组织太慢或太快。

缓慢或快速冷冻组织会引起冷冻伪影。使用液氮喷雾，直到看到OCT开始冻结或放入低温恒温器进行适当的冻结。请咨询冷冻器制造商，以获得切割组织的合适温度。有关正确冷冻组织的方法，请参考其他参考文献。

工件，褶皱，压缩和刀线意味着间隙角太大和/或钝，切口刀片。

确保刀片锋利，干净，角度合适(~5°)。

不正确或不推荐的固定物。

确定组织的最佳固定剂，一般为丙酮或10%中性缓冲福尔马林。如果信号太弱，使用者可能会尝试长时间固定纸巾(例如2-3分钟)。

阻滞剂潜伏期过短(或根本没有)——未被阻断的内源性组织元件与一抗和/或显色原无特异性相互作用。

确保在建议的时间内完成阻塞。

试剂交叉污染。

确保所有试剂根据各自的试剂标签进行适当的存储;如果抗体试剂容器出现浑浊或容器中有沉淀物，轻轻混合。如果试剂在规定的稳定性日期内，并且浑浊持续存在，请考虑更换新的试剂瓶，并联系Novodiax技术支持。

交叉污染或内源性过氧化物酶。

确保所有试剂根据各自的试剂标签进行适当的存储;作阴性试剂对照，省略抗体，只作显色剂(DAB)。如果发生染色，则先前染色的组织切片可确认为内源性过氧化物酶。或者，组织可以用H2O2处理并重复测试。

组织的颤动和裂纹

间隙角不足和/或切割速度不合适。

确保使用合适的间隙角和切削速率。

难以区分细胞形态

苏木精培养时间过长或过短——培养时间取决于浓度和病理学家的偏好。

2-45秒通常足够了;反染色强度应针对每种组织类型、固定方案和所需的免疫染色强度进行优化。对于渐进式反染剂(Mayer’s, Gill’s)，通过改变培养时间来控制强度;对于回归反染色(Harris)，调整染色时间以达到所需的强度。

氧化产生结晶沉淀物

苏木精暴露于光氧化产生晶体沉淀物，在显微镜下观察;这些晶体结构可能会分散注意力，在某些情况下，使准确的诊断变得困难。

确保按照制造商的建议经常更换苏木精和/或过滤。

玻片外观浑浊

没有脱水或脱水不充分——水分没有完全排出，造成组织模糊外观;细胞形态也会受到影响。

通过新鲜的酒精和清除试剂重新运行载玻片。如果问题仍然存在，更换脱水/清除试剂。化学试剂应根据使用情况经常交换。试剂在一步一步进行时可能会被稀释。实验室应考虑至少每隔一周更换一次试剂。